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文章總體分析路線,如下圖:


這篇文章的巧妙嚴謹之處在于:

1. 這篇文章是研究赤霉素(GA)和脫落酸(ABA)對花瓣發育互為相反的作用機制的,作者是怎么選材和設置激素處理時間點的呢?

首先作者每天用GA或ABA噴涂花絮一次,9日后收樣,并測量花瓣長度。
結果顯示GA顯著促進了花瓣的延長,而ABA處理的花瓣比正常對照顯著縮短,說明這兩種激素在調控花的發育(大小)方面起著相反的作用。



然后作者用以上的方法同樣處理離體的花瓣,并測量頂部、中部和基部三個部位的花瓣長度和細胞長度,結果顯示GA處理組的三個部位的細胞長度都顯著增長,而ABA處理組的細胞長度只在基部明顯縮短。這些結果說明了花瓣延長與細胞延長有關,并且GA和ABA的相反作用只局限于基部位置。


然后作者用一種激素處理花瓣2h, 12h, 24h后,加入另一種激素,來研究GA和ABA的聯合作用。發現這兩種激素都能減弱對方的作用,并且ABA只在GA處理2h后顯著減弱GA的增長效果,而GA在ABA處理2h和12h后都顯著增長了花瓣長度,說明GA和ABA的效應是相反的,并且這些效應在12h后就不再顯著。


基于這些結果,因此作者選擇了激素處理2h和12h后的花瓣基部,來做RNA測序。


2. 找出差異表達基因后,作者是怎樣挖掘出與GA和ABA促進和抑制作用相關的關鍵通路和基因呢?

因為GA和ABA這兩種激素對非洲菊花瓣發育的作用是相反的,因此作者把差異基因(DEGs)分成三類,第Ⅰ類是GA或ABA處理2h比上正常對照(con vs GA2h, con vs ABA2h ),第Ⅱ類是GA或ABA處理12h比上處理2h(GA2h vs GA12h, ABA2h vs ABA12h),第Ⅲ類是GA或ABA處理12h比上正常對照(con vs GA12h, con vs ABA12h )。并統計了這三類DEGs在GA和ABA中表達模式相反的基因數目(GA-up, ABA-down,或GA-down, ABA-up)。


隨后的GO功能富集分析也是按照這三大類DEGs來分別分析的:
在第Ⅲ類DEGs(12h)中,差異基因顯著富集于“cell wall organization”這個GO條目中,特別是子類“cell wall loosening”,這些編碼擴展蛋白的差異基因被GA激活,但被ABA抑制,而擴展蛋白被認為是細胞延長的分子標記。

在第Ⅱ類DEGs(12h/2h)中,差異基因富集于“凋亡”這個GO條目中,并且在GA中上調,在ABA中下調。這些基因編碼了一組病原相關抗病蛋白,雖然GA和ABA可調節病原體引起的植物免疫應答,然而凋亡在GA/ABA調控的花瓣發育中到底起什么作用還需要更進一步的研究。

在第Ⅰ類DEGs(2h)中,差異基因顯著富集于“轉錄調控”這個GO條目中,并且在GA中下調,在ABA中上調。這些差異基因包括了9個轉錄因子(TF)。

結合已有的報道和現有的數據,作者得出這些轉錄調控因子在非洲菊花瓣的細胞生長方面起著重要作用,GA處理后,TF被抑制,因此被TF抑制的與細胞壁松散、凋亡相關的基因得到表達,細胞得到延長;相反,ABA激活了TF,從而抑制了細胞延長。

然后,KEGG富集結果也不出意外的顯示,差異表達基因在所有樣本中都顯著富集于植物激素信號通路(plant hormone signal transduction)。另外,多種激素相關信號通路也顯著富集,如與赤霉素生物合成和代謝相關的雙萜類生物合成通路(diterpenoid biosynthesis pathway)、與ABA生物合成和代謝相關的類胡蘿卜素生物合成通路(carotenoid biosynthesis pathway),這與之前報道的非洲菊花瓣發育與一系列相互聯系的激素信號通路有關的結論一致。

然后,作者將參與了GA和ABA合成、代謝和信號通路的DEGs作熱圖聚類分析,結果顯示GA或ABA處理2h后,大部分DEGs顯示出相反的表達模式,但處理12h后表達模式類似,表明了激素相關信號通路的轉錄調控在花發育過程中是早期的短暫的(下圖D-G)。


小結

這篇文章是典型的植物發育轉錄調控分析的文章,有兩點值得我們借鑒:
1. 實驗設計與取材。作者通過一系列的預實驗,證明了GA和ABA對花瓣發育起相反作用的位置是花瓣基部,并且在2h和12h比較顯著。
2.如何從一大堆差異表達基因里面找出與研究相關的關鍵基因。就是要回歸生物學意義,根據樣本的特點,對差異基因進行分組分類。比如本文根據GA和ABA對花瓣發育的相反作用,把在GA和ABA處理組中呈相反表達趨勢的基因分為一類,這樣就使邏輯變得清晰,問題變得簡單,并且更貼近于研究目的。

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