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通過抑制EZH2恢復IKKa的表達促進了鼻咽癌細胞的分化

合作單位:中山大學附屬腫瘤醫院

文章下載鏈接:http://www.hfuoe.tw/uploads/tmp/genedenovo-resume-1481271661.6932067.pdf

研究背景與目的:
95%的鼻咽癌(NPC)都是Ⅲ 型不分化惡性腫瘤,這為腫瘤誘導分化治療提供了契機。目前腫瘤誘導分化治療已經成功在多種惡性腫瘤,包括白血病、神經母細胞瘤中得到應用,但所涉及的具體分子機理還不清楚。因此,闡明鼻咽癌細胞不分化的分子機制,可以為尋找腫瘤誘導分化治療的藥物靶點提供潛在的理論依據。

實驗材料:
3對鼻咽癌組織(2T,3T,23T)和癌旁組織(2N,3N,23N),共6個樣本。

研究結果:
1. RNA-seq尋找候選基因——IKKα在不分化鼻咽癌組織中表達下調
對鼻咽癌組織和癌旁組織進行RNA-seq檢測,結果顯示,與癌旁組織相比,與上皮細胞分化相關的13個基因(包括IKKα)的表達量在三個NPC病人組織中都顯著下調。對包括IKKα在內的7個基因進行qPCR驗證,結果都與RNA-seq結果一致。

在這幾個經過驗證的候選基因中,為什么選擇IKKα來研究?原因有兩點:
1)前期研究表明,IKKα除了參與經典的NF-κB信號通路,還通過一種不依賴于NF-κB的途徑影響上皮細胞的分化;
2)在另外5對癌-癌旁組織中也檢測到IKKα表達下調,并且在正常鼻咽組織和高度分化的鼻咽癌細胞系(CNE1)中表達量很高,而在多個低分化的鼻咽癌細胞系(CNE2,SUNE1,HONE1)中低表達(圖1)。
因此,文章后續就圍繞IKKα這個基因,通過各種分子細胞實驗,來研究其中的分子機制。


圖1 IKKα的表達量在另外5對癌-癌旁組織中下調(左);IKKα在多個低分化的鼻咽癌細胞系中低表達

2. 分子細胞實驗驗證IKKα功能——能夠誘導細胞分化并減少細胞的腫瘤發生
在高度分化的鼻咽癌細胞系CNE1中利用siRNA技術沉默IKKα的表達,western blot實驗顯示,siRNA沉默IKKα顯著減少了上皮細胞分化因子involucrin和CK8的表達,表明NPC細胞的不分化與IKKα表達下降有關(圖2)。然后通過體外過表達實驗和體內移植瘤實驗,證明了IKKα能夠誘導細胞分化并減少細胞的腫瘤發生(圖3,圖4),而且這并不依賴于NF-kB信號通路激活。


圖2 siRNA沉默IKKα顯著減少上皮細胞分化因子involucrin和CK8的表達


圖3. 體外過表達實驗證明IKKα能夠誘導細胞分化并減少細胞的腫瘤發生


圖4. 體內移植瘤實驗證明IKKα能夠減少細胞的腫瘤發生

 

3. 鼻咽癌細胞低分化的分子機制研究——IKKα被EZH2介導的啟動子H3甲基化所抑制
分析發現,IKKα的啟動子區域含有一致性polycomb反應元件,猜測PRC2可能參與了IKKα的表達抑制。


polycomb蛋白家族
polycomb蛋白家族是一類進化上極為保守的轉錄抑制因子,polycomb蛋白形成的polycomb抑制復合物(PRCs)通過表觀抑制的方式,在多種腫瘤中有著重要的作用。EZH2是PRC2復合物的一個具有催化活性的組成成分。

western blot結果顯示EZH2和H3K27me3在低分化的鼻咽癌組織細胞中表達量大幅提高。然后通過CHIP、siRNA沉默EZH2、熒光素酶報告基因等實驗,表明EZH2通過H3K27me3組蛋白甲基化來沉默IKKα的轉錄表達(圖5)。


圖5 western blot(b), CHIP實驗(c),siRNA沉默實驗(d),熒光素酶報告基因(f)結果

4. 誘導分化治療藥物驗證
維甲酸(RA)是一種用于多種人類腫瘤誘導分化治療的藥物。為了檢測促分化藥物維甲酸在鼻炎癌中是否通過IKKα途徑起作用,利用western blot、CHIP、熒光素酶報告基因、移植瘤等實驗多方面驗證,結果都發現維甲酸能夠抑制EZH2的表達,使IKKα表達量升高,從而促進了腫瘤細胞的分化(圖6)。


圖6 維甲酸促進腫瘤細胞的分化

總  結:
1. 這是一篇非常典型的醫學類文章,由于臨床醫學研究的最終目的是用于臨床診斷和治療,所以嚴謹性往往比其他的動植物基礎研究要高得多。這篇文章綜合運用了多種分子、細胞實驗來驗證,并且用真實的臨床治療藥物來驗證,論證嚴謹嚴密,而且臨床意義較大。

2. 我們可以看到,RNA-seq在整個研究中的作用是前期篩選候選基因。RNA-seq或者其他的組學研究只是整個生物學問題研究的一部分,得到候選基因后,對候選基因的功能驗證也是非常重要的。因此在設計實驗的時候,要有從前到后的整體意識,才能讓我們的研究更充分完整,發表的文章檔次更高。

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